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本发明涉及固相萃取柱制备领域,公开了一种碱性嫩黄O分子印迹固相萃取毛细管柱及其制备方法和应用。制备方法为:S1.将功能单体甲基丙烯酸加入到碱性嫩黄O中,然后加入致孔剂,超声使碱性嫩黄O溶解;再加入交联剂和引发剂,超声,通氮气;S2.用预处理过的毛细管吸取S1得到的产物,两端封口,紫外条件下,冰浴聚合,生成碱性嫩黄O的分子印迹固相萃取毛细管柱;S3.洗脱模板分子,即得碱性嫩黄O分子印迹固相萃取毛细管柱。所得的固相萃取毛细管柱是一种具有固定空穴大小、形状和有确定排列功能的高分子交联聚合物,对碱性嫩黄O分子的立体结构具有动态“记忆”功能,能实现碱性嫩黄O特异性、选择性分离和高效富集。